文章来源：半夏 药靶孺子牛
绝经后骨质疏松症（PMOP）是由于卵巢功能衰竭导致雌激素流失引起，成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收导致的骨稳态不平衡被认为是骨质疏松症的主要原因。尽管临床上有多种药物可用于骨质疏松症治疗，但严重的副作用限制了其进一步的推广和应用。具有纳米级膜结构的细胞衍生纳米囊泡（NV）通过运输生物信息，包括核酸、蛋白质、脂质和代谢物，调节生物体的生物学功能。中草药来源的细胞外囊泡样纳米颗粒具有多种优势，包括生物相容性、成本效益、生态友好性并可大规模生产。
骨碎补（Rhizoma Drynariae）是一种具有补肾强骨功效的中草药，常用于临床治疗骨相关疾病。然而，中药有效成分在体内溶解性差、分布不均等问题亟待解决，此外，骨碎补在抗骨质疏松症中的有效成分及其功能仍不清楚。新鲜草药衍生的NVs已被研究为天然活性成分的合适载体，作者推测骨碎补衍生的纳米囊泡（RDNV）富含特定的生物功能分子，可以用作合适的治疗纳米平台。
2024年2月10日，广州中医药大学赵可伟、南方医科大学郑磊、南京中医药大学乔宏志团队合作在Acta Pharm Sin B（IF=14.8）发表了题为“Rhizoma Drynariae-derived nanovesicles reverse osteoporosis by potentiating osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells via targeting ERα signaling”的文章，揭示新鲜草药骨碎补中分离的纳米囊泡（RDNV）对绝经后骨质疏松症的治疗潜力，并证明RDNV通过靶向ERα增强人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）的增殖和成骨分化。此外，RDNV中的柚皮苷是成骨作用中靶向ER α的活性成分。
在这项研究中，作者证明从新鲜草药骨碎补（Rhizoma Drynariae）中分离的纳米囊泡（RDNV）是一种活性ERα激动剂，RDNVs通过诱导hBMSC成骨分化和骨形成对绝经后骨质疏松症（PMOP）具有有效的治疗作用。此外，RDNVs靶向股骨组织但没有器官毒性。重要的是，通过高效液相色谱（HPLC）验证和生物信息学分析，发现柚皮苷（naringin）是RDNV的一种生物活性物质，它通过激活hBMSC中ER α信号传导促进BMP2和RUNX2表达，促进成骨细胞形成（图1）。
图1 RDNV靶向ERα信号传导增强hBMSC成骨分化来逆转骨质疏松
1、RDNVs的物理化学表征
作者通过差速离心从新鲜的碎骨补中获得和纯化RDNV，并通过透射电子显微镜（TEM）、Flow NanoAnalyzer、Nanoview进行了表征，且不同的pH条件下，RDNVs粒径和浓度稳定。因此，可以从天然中药碎骨补中分离出稳定、可靠和丰富的RDNV（图2A-D）。
接着，作者分别通过琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和TLC发现RDNVs中存在RNA、蛋白质和脂质，表明RDNV可能在细胞间信号传导中发挥作用，并通过蛋白质、RNA和脂质发挥广泛的生物学功能（图2E-G）。
采用中药特色图谱技术对药材质量进行评价，具有良好的稳定性和准确性。为了确定获得的RDNVs是否与碎骨补共享特征图谱，作者采用高效液相色谱（HPLC）发现柚皮苷（naringin）存在于RDNV中，且不同批次RDNV中柚皮苷的浓度是稳定的（图2H-I）。
图2 RDNV的鉴定和物理化学表征
3、RDNV在体内是骨靶向的
为了确定RDNV在体内的分布，DiR标记的RDNV通过静脉注射和腹腔注射给予雌性C57BL/6J小鼠。结果显示在静脉注射和腹腔注射后48h发现了股骨中RDNV的最大富集量。此外，在肝脏中观察到大量RDNV，在脾脏和肺中的存在较少。
接着，作者分离了雌性C57BL/6J小鼠股骨的小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs），分析DiI标记的RDNVs标记mBMSCs的效率，发现mBMSCs体内DiI标记的RDNVs摄取阳性率在48小时可达>35%，结果表明RDNVs在体内被股骨中的BMSC吸收（图3）。
图3 RDNV在体内的生物分布
4、RDNV减轻体内骨质流失
为了评估RDNVs对PMOP的治疗效果，作者建立了卵巢切除（OVX）小鼠模型，腹腔注射RDNVs。结果显示RDNV逆转了骨质疏松症引起的骨钙缺乏和股骨碱性磷酸酶（ALP）升高，表明 RDNVs可以有效缓解体内骨质流失，从而预防或逆转骨质疏松症。此外，生物相容性分析显示RDNVs没有明显组织损伤和肝肾功能相关血清学参数异常（图4）。
图4 RDNV改善卵巢切除术诱导的体内骨质流失
5、RDNV可在体外被hBMSCs摄取
作者获得了原代hBMSCs，发现亲脂性荧光染料 DiI 标记的RDNV被hBMSC内化，主要分布在细胞核周围的细胞质中，在48小时可更有效地被hBMSCs内化。此外，四种内吞作用抑制剂可以显著抑制RDNV的内吞作用，表明小窝介导的内吞作用参与RDNV的细胞摄取（图5）。
图5 RDNV可在体外被hBMSCs摄取
6、RDNV在体外促进hBMSC增殖和分化
接着，作者发现RDNVs显示出显著的hBMSCs促增殖能力，且对hBMSCs细胞凋亡无影响。因为类黄酮与雌激素结构相似且碎骨补具有类似植物雌激素的作用。作者推测RDNV可能会充当ERα激动剂以激活雌激素途径。结果显示RDNV在hBMSC增殖过程中时间依赖性地增强了ERα mRNA表达水平。此外，茜素红染色等实验发现RDNV可以像雌激素一样诱导成骨分化。机制上，RDNV激活ERα信号促进BMP2和RUNX2表达，激活BMP/Smad通路（图6）。
图6 RDNV在体外促进hBMSC增殖和分化
7、RDNVs有效成分靶向ERα信号传导
为了进一步验证RDNVs有效成分及可能机制，作者对RDNVs进行了成分分析，共鉴定了3075种物质。据报道，黄酮类化合物如槲皮素、淫羊藿苷和柚皮苷与促成骨特性和骨形成显著相关。因此，作者专注于RDNVs中的黄酮类化合物。将RDNVs中所含的成分与碎骨补中的115 种活性成分取交集，发现11种交叉成分，其中柚皮苷含量最高。
将碎骨补的115种成分的靶基因与4957个骨质疏松症相关基因取交集得到的77个基因开展KEGG分析，雌激素信号通路显著富集，且RDNV和碎骨补中共有的11种成分中大多数与骨质疏松症的核心信号靶标有关，PPI网络显示ESR1（ERα）是参与骨质疏松症信号通路的最重要蛋白质之一。将11种成分与Erα进行分子对接发现柚皮苷与Erα具有稳定的结合，通过表面等离子体共振（SPR）和药物亲和反应靶点稳定性（DARTS）证实柚皮苷与ER α的直接结合。因此，ERα被认为是柚皮苷的结合靶点（图7）。
图7 RDNVs有效成分靶向ERα信号传导
总结
从新鲜草药骨碎补（Rhizoma Drynariae）中分离的纳米囊泡（RDNV）在卵巢切除小鼠模型中表现出有效的骨组织靶向活性和抗骨质疏松症功效。RDNVs 被 hBMSCs 有效内化，增强 hBMSC 的增殖和 ERα表达水平，促进成骨分化和骨形成。从机制上讲，通过 ERα 信号通路，RDNV 促进了 hBMSC 中BMP2和RUNX2表达的 mRNA 和蛋白表达，这些蛋白参与调节成骨分化。进一步分析显示，存在于 RDNV 中的柚皮苷是成骨效应中靶向 ERα 的活性成分。
参考文献
Zhao Q, Feng J, Liu F, Liang Q, Xie M,
Dong J, Zou Y, Ye J, Liu G, Cao Y, Guo Z, Qiao H, Zheng L, Zhao K. Rhizoma
Drynariae-derived nanovesicles reverse osteoporosis by potentiating osteogenic
differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells via targeting ERα
signaling. Acta Pharm Sin B. 2024 May;14(5):2210-2227. doi:
10.1016/j.apsb.2024.02.005. Epub 2024 Feb 10. PMID: 38799625; PMCID:
PMC11119514.
